Меры предосторожности при эксплуатации и применения генной амплификации гена усиления, т.е. мониторинга в реальном времени продуктов ПЦР-амплификации и метод анализа, он добавляется в системе ПЦР в флуоресцентным веществом, и ход реакции с помощью систем ПЦР обнаружения для ПЦР Интенсивность флуоресценции сигнал мониторинга в реальном времени, окончательного анализа и обработки экспериментальных данных. Описывает процесс динамической кривой кривой ПЦР-амплификации. Это в действительности не является стандартной экспоненциальной кривой, но S-образной кривой, это происходит потому, что с увеличением количества циклов ПЦР инактивации ДНК-полимеразу, дНТФ и грунтовка истощение отраженные побочные ингибиторы синтеза пирофосфат реакции и другим причинам, не всегда в результате ПЦР-амплификации в геометрической прогрессии, и в конечном счете в плато. Из-за сложности факторов, влияющих на ПЦР-амплификации, платформа времени каждой ПЦР-амплификации сигнала и уровень изменения трудно точно контролировать. Платформа изменений, но в регионе, усиления областях кривой роста, легко воспроизводимым, количественный ПЦР-анализ является очень важным, если вы установите в соответствующее место в усилении роста кривой флуоресценции области порогового предела обнаружения порогового значения (порог) будут получены со значением Ct точки пересечения кривой амплификации, Ct значение числа циклов (пороговый цикл), когда порог достигнут, значение КТ и количество первичных шаблон обратно пропорциональна логарифму линейная зависимость. Эксплуатация амплификации гена проблемы, которые требуют внимания: ПЦР праймеров: праймеров может быть наиболее критических факторов успеха ПЦР-амплификации. Бедный дизайн праймер может привести к отсутствию продукта амплификации, даже усиливается недостаточность, причина плохой конструкции из праймеров может приводить к неспецифической амплификации и / или образование димера праймера, и это стало конкурентным продуктом реакции PCR , тем самым дополнительно ингибирования образования продукта ПЦР. Следующие факторы необходимо учитывать при проектировании праймеров, один из наиболее важных является длина праймера, температура растворения (Tm), специфичности праймера последовательности, комплементарные к этой проблеме, G / C контента и мульти-пиримидина (Т, С) или более пурин ( , G), проходящий в 3'-концевой последовательности. (1) длины праймеров: Из-за специфичности реакции ПЦР, температуры отжига и времени, по крайней мере частично с длиной ПЦР-праймеров связана, поэтому длины праймеров для амплификации ПЦР критическим фактором успеха. Генеральный ПЦР-праймеры из 15-30 нуклеотидов в длину. (2) температура растворения (Tm): отопление и отсоедините H ключ, двухцепочечной ДНК отделить, или ?растворяется? в одноцепочечной ДНК. Температура растворения (Tm), который направлен половины двухцепочечной ДНК в одноцепочечной ДНК от температуры. Tm может быть рассчитана по следующей формуле: ТМ = 2 (А + Т) + 4 (G+ C). Нужно обратить внимание на реакции амплификации генов по крайней мере два (пара) http://www.jntckj.cn/ грунтовки, два олигонуклеотидных праймера Tm значения должны быть близки к, а не разница слишком велика. Чем выше величина Tm грунтовки несоответствия может происходить при более низкой температуре реакции, а в нижнем Tm значение грунтовки, температура реакции выше, не могут играть важную роль, например, грунтовка Tm значение разности больше, может быть вызвать ПЦР-амплификации неэффективно или не усилится. (3) праймера, комплементарного последовательности: проектирование праймеры должны быть абсолютно не более 3 нуклеотидов внутренней пары праймеров, таких как грунтовки, имеющий область само спаривание "воспроизведение", то есть частично двухцепочечной структуры будет происходить, когда реакции отжига. (4) G / C контента и мульти-пиримидина (Т, С) или более пурин (A, G), проходящую: Последовательности праймеров быть выбран должно быть, как указано выше, и нуклеотидную распределения, среднее G+ C контент - избежать длительных + T и G+ C-богатый регион. В пары праймеров GC содержание 45% -55%. Должны быть выбраны последовательности праймеров продлив не более G или C, A и T расширение также следует избегать, поскольку это может способствовать неспецифической отжига, поскольку он может ?дышать? и грунтовки - матричный комплекс Развернуть продление, сокращение Эффективность амплификации. Пиримидина (Т, С) и пуринов (А, С) и простирается также следует избегать. (5) 3'-концевой последовательности: праймер для управления несоответствия, должны быть тщательно определить местоположение ПЦР-праймеры, 3'-конец. В заключение следует обратить внимание на дизайн ПЦР-праймер, дизайн ПЦР-праймеров должны быть тщательно осторожны. Для успешного ПЦР несколько важных факторов, таких как длина праймера, GC содержание и последовательность 3 'должны быть оптимизированы. Идеально праймер должен быть смешан, как указано выше и распространяется почти нуклеотидных GC содержание 50%, приблизительно 20 оснований в длину, что позволяет значение Tm находится в диапазоне 56-62oC. Анализ потенциальных генов-мишеней грунтовка сайтов, не следует рассматривать ни один полимер, не существует никаких значительных вторичных тенденции формирования структуры, а не самодополнительных, нет существенной гомологии с другими двухцепочечную последовательность гена-мишени. Чтобы избежать тупой дизайн, сэкономить время и уменьшить количество ошибок, могут быть применены к компьютерной программе для оптимизации конструкции, отбор, определенных олигонуклеотидного праймера. Cycler областей применения: фундаментальные исследования нуклеиновых кислот: геномный клон Асимметричная ПЦР подготовке одноцепочечной ДНК обратной ПЦР для секвенирования ДНК неизвестного участка ДНК измерялась ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) используется для обнаружения ячейки уровня экспрессии генов вирусной нагрузки РНК, так и непосредственно клонировали ген-специфических кДНК флуоресцентной количественной ПЦР используется для применения мониторинга в реальном времени ПЦР-амплификации продукта концов кДНК для обнаружения экспрессии генов медицинского применения: обнаружение бактерий, вирусных заболеваний; диагностики наследственных заболеваний; диагностики рака; биологические доказательства. Диагностика генетических заболеваний и некоторых сложных заболеваний и беременным женщинам пренатального обнаружения возбудителя помощи. Некоторые злокачественные заболевания, общей микробиологии, биохимических и иммунологических методов не может обнаружить возбудителей, ПЦР может быть использована для проверки. Судебно-криминалистическая идентификация. ПЦР для чувствительного обнаружения генетических связей между родственниками и биологические остатки следов образцах были выявлены, следовательно, уголовного розыска чрезвычайно полезны. Ген рака инспекции. Подготовка зонд гена. Секвенирование генома хромосомы посещений. Конструирование кДНК библиотеки. Анализ гена мутации и мутагенеза. Рекомбинации ДНК. Совместное использование и клонирование гена.